0.1%胰蛋白酶液消化液 NobleRyder P0930
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常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶服務品質。一般說來的發生，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的消化影響，胃蛋白酶主要用于細(xì)胞間抗原的消化新的動力。工作中要認(rèn)真參照抗體說明書指示進(jìn)行消化酶的選擇，這樣針對性更強(qiáng)發展契機，標(biāo)記效果更理想廣泛關註。
問：為什么要進(jìn)行抗原修復(fù)：
答：福爾馬林固定時(shí)促進進步，組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉優勢領先。同時(shí)迎來新的篇章，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡(luò)推動並實現，也導(dǎo)致了抗原決定簇被掩蓋薄弱點，這就使得相當(dāng)部分的抗原不能與抗體很好是進(jìn)行反應(yīng)。因此優化程度，抗原修復(fù)也是影響免疫組化染色結(jié)果的基本因素積極性。
抗原修復(fù)中檸檬酸緩沖液的配制方法：
A液：枸櫞酸，C6H8O7.H2O不斷豐富，21.01g 加水定容至1000ml實施體系；
B液：枸櫞酸鈉，C6H5Na3O7.2H2O, 29.41g 加水定容至1000ml;
使用時(shí)： A液9 ml, B液41 ml各有優勢，加水至500ml發揮，即可配成工作液。
抗原修復(fù)（Antigen retrieval 更加堅強，AR）技術(shù)與時俱進，是指石蠟、冰凍初步建立、火棉膠綜合運用、塑料切片免疫組織化學(xué)（IHC）前用胰蛋白酶、尿素的方法、表面活性劑實事求是、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)過程落到實處》账?？乖迯?fù)能zui大程度地恢復(fù)在制片等過程中損失的抗原性，使原來認(rèn)為不能在石蠟切片上進(jìn)行IHC的許多抗體獲得了良好的染色結(jié)果技術創新，成為一種有效的補(bǔ)救措施處理方法。本文的目的是概述AR-HIC的發(fā)展、應(yīng)用和標(biāo)準(zhǔn)化持續向好。
一習慣、 AR技術(shù)
加熱AR技術(shù)
微波加熱方法. 在傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法,經(jīng)脫蠟、脫水和用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧（化）物酶進展情況，石蠟切片經(jīng)蒸餾水沖洗的積極性，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸餾水不久前、緩沖液用上了、金屬鹽液、尿素等能力建設，蓋上并置家用微波爐加熱5或10分鐘（注意防止切片干躁）可靠保障。有時(shí)在加熱5分鐘后，間隔1分鐘設計標準，再加熱5分鐘（在*個(gè)5分鐘后檢測液體高度）開展。加熱后，從微波爐取出塑料Coplin缸發揮重要帶動作用，冷卻15分鐘意向。片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次后在PBS液中浸5分鐘，才進(jìn)行IHC染色文化價值。為了保持*的加熱條件發展空間，必須設(shè)定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號的Coplin缸 ，按照不同的抗體設(shè)定不同的加熱時(shí)間有所應，盡可能的建立標(biāo)準(zhǔn)的加熱條件足了準備。
微波（MW）加熱過程如下：在盒內(nèi)放入200ml檸檬酸緩沖液（PH6.0±0.1），并蓋上帶有小孔的蓋子著力提升，微波加熱至沸騰深刻內涵；將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中，放入已沸騰緩沖液中融合，有作者提供做免疫組化時(shí)采用微波爐中等功率800W[3]深入闡釋，微波爐選用解凍檔的國產(chǎn)家用微波爐（根據(jù)目前的研究,建議用醫(yī)用微波爐），中檔繼續(xù)處理10-20分鐘完成的事情；取出微波塑料缸冷卻至室溫物聯與互聯，從緩沖液中取出玻片，片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次改造層面，之后用PBS（PH7.2-7.4）沖洗兩次供給，每次3分鐘。
盡管有少數(shù)作者[4]認(rèn)為經(jīng)高溫后冷卻這一步省略經驗分享。在我們觀點(diǎn)解決方案，15分鐘的冷卻必須的幾點(diǎn)理由：1、如這一步省略不難發現，對于有些抗體而言貢獻法治，會(huì)降低AR-IHC染色強(qiáng)度設備製造。2發展需要、突然從高溫到低溫可導(dǎo)致組織片掉片。3、可能引起形態(tài)學(xué)的變化顯示。
單純加熱方法. 將切片放入盛有檸檬酸緩沖液的容器中,置電爐（600W）上加熱至沸騰雙向互動，并持續(xù)10min 。Shi等人[2]用單純加熱方法與微波加熱方法比較IHC染色強(qiáng)度設計能力，顯示兩種方法導(dǎo)致相同的染色強(qiáng)度品牌。
高壓加熱方法. Shin等人[5]發(fā)展了含水高壓鍋煮沸方法，來增強(qiáng)福爾馬林固定的腦組織tau蛋白免疫反應(yīng)性更為一致。將切片連同檸檬酸緩沖液放入高壓鍋內(nèi)等形式，加熱至產(chǎn)生噴氣，并持續(xù)2min研究與應用，壓力鍋離開熱源相貫通，加熱長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋到壓力鍋離開熱源總時(shí)間在5-8分鐘積極影響，時(shí)間過長可能會(huì)使染色背景加深∽詣踊桨?，F(xiàn)試劑公司提供的大多數(shù)抗體都建議使用高壓鍋煮沸方法，這幾年的實(shí)踐表明越來越重要，采取此方法可避免假陽線上線下、陰性，使IHC染色效果更佳醒悟。
非加熱AR技術(shù)
非加熱AR技術(shù)包括酶消化數據顯示、酸水解等方法。目前也逐步提升，主要是酶消化達到，酶消化是以化學(xué)的方法來打斷醛鍵，修復(fù)抗原不可缺少。
胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05％或0.1％PH7.8的無水氯化鈣水溶液中蓬勃發展，溶解即可；或用0.125%的液體胰酶積極回應。將切片放入濕盒內(nèi)37oC溫箱中消化18-20分鐘重要性。
胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4％的胃蛋白酶；
鏈霉蛋白酶消化法 . 將鏈霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中多種場景，濃度為o.1％多元化服務體系，消化時(shí)間20min。
抗原修復(fù)的方法選擇擴大公共數據，關(guān)系到組織抗原能否暴露充分深度，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特點(diǎn)核心技術體系，采用不同的修復(fù)方法開拓創新。對某些細(xì)胞內(nèi)抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和細(xì)胞間質(zhì)抗原（如Laminin促進善治、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片擴大。常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說來發揮效力，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱新格局，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細(xì)胞間抗原的消化指導。工作中要認(rèn)真參照抗體說明書指示進(jìn)行消化酶的選擇管理，這樣針對性更強(qiáng)緊密協作，標(biāo)記效果更理想結構。
總之,以高壓加熱方法合作、微波加熱方法較為穩(wěn)定, 高壓加熱方法效果優(yōu)于微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對修復(fù)效果無任何影響關規定，而PH值則影響較大發展基礎。緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCL較常用。前人的研究表明建強保護，溫度高修復(fù)時(shí)間短[6]同期。解放軍第251醫(yī)院根據(jù)臨床病理診斷、鑒別診斷和研究的實(shí)際需要使命責任，在抗原修復(fù)方法規(guī)范研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)上效果，創(chuàng)用了胰蛋白酶—尿素聯(lián)合消化技術(shù)、鹽酸水解暴露抗原技術(shù)和MW—表面活性劑Triton X—100（MW—TX）修復(fù)抗原技術(shù) [7] 合規意識∶芏仍黾?？乖┞痘蚩乖迯?fù)方法較多，其中發(fā)MW—枸櫞酸緩沖液使用較多創新內容，效果機遇與挑戰。MW修復(fù)抗原的方法是石蠟切片脫蠟、水洗后放入修復(fù)液中善於監督，用250W的輸出功率2X5min集成技術，待冷卻至室溫按常規(guī)處理。目前AR過程已成功應(yīng)用在BioTek全自動(dòng)免疫組化染色儀中更合理。
二適應能力、AR應(yīng)注意的問題
加熱持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度是重要的影響因素之一，
AR液的PH值各方面、濃度防控、化學(xué)成分也是重要的影響因素之一。
使用低PH值AR液必須使用陰性對照片適應性，以防止定位不準(zhǔn)[9]堅實基礎。Shi等人[10]強(qiáng)調(diào)修復(fù)緩沖液的PH值對某些抗原的修復(fù)十分重要,實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)要獲得滿意結(jié)果必須選擇抗原修復(fù)液的zui適PH值稍有不慎。在常規(guī)石蠟切片做AR-IHC，采用不同濃度的Alcl3液做AR液深入闡釋，發(fā)現(xiàn)4%的Alcl3取得的染色[11]規模最大。在修復(fù)的抗原中穩中求進，金屬鹽可影響蛋白的結(jié)構(gòu)統籌。鄭輝等人[12]使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L檸檬酸緩沖液協同控製、0.1mol/L Tris-HCL緩沖液及1mmol/L EDTA-Na2振奮起來，于微波修復(fù)抗原，發(fā)現(xiàn)其陽性強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)利用好。
高溫抗原修復(fù)因其機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜深入各系統，對某些存在的問題很難用設(shè)計(jì)對照的方法加以解決，有些抗體在冰凍切片上呈陰性反應(yīng)系列，但在石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好的顯示作用。對某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或表達(dá)在核內(nèi)的抗原，經(jīng)過量修復(fù)后慢體驗，絕大部分表達(dá)在核內(nèi)著力增加，例如，P185科技實力、Bcl-2處理、P-gp、Nm23在此基礎上，而有些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)過量修復(fù)會(huì)出現(xiàn)在胞漿內(nèi)助力各行，例如P53、PcNA自主研發、Ki-67等[6]確定性。在使用該方法時(shí)一定小心，對結(jié)果的判斷也要客觀地作出分析損耗，侯寧等人發(fā)現(xiàn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TRT）經(jīng)過抗原修復(fù)與不經(jīng)過抗原修復(fù)相貫通，其染色效果明顯不同，后者的陽性率明顯高于前者[8]積極影響。操作中還應(yīng)注意如下問題：
1自動化方案、熱處理后應(yīng)注意自然冷卻。
2越來越重要、熱處理時(shí)要防止切片干燥線上線下。
3、應(yīng)根據(jù)不同的抗體選擇合適的抗原修復(fù)方法醒悟。
4數據顯示、一批抗原的檢測其溫度和時(shí)間一定保持*發展目標奮鬥。
5、注意形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變（一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿會(huì)明顯的破壞更多的合作機會，而對細(xì)胞核的影響較大延伸，會(huì)出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染等現(xiàn)象服務好，而經(jīng)酶水解的切片新趨勢，其細(xì)胞漿破壞視消化時(shí)間而異，但核破壞較輕）共謀發展。
6學習、如果在常用的緩沖液中無法實(shí)現(xiàn)抗原修復(fù)，或經(jīng)修復(fù)后抗原定位發(fā)生改變聽得懂，可改用一些不常用的緩沖液應用優勢，或加一些螯合劑，如EDTA等可改善某些抗原的修復(fù)全方位。
用于IHC消化的酶很多高效節能，所選酶的種類，使用的濃度大局，PH值新創新即將到來，消化時(shí)間及溫度等均要視組織固定的不同，所檢測抗原的性質(zhì)主動性、組織類型的不同而異創造性，應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索確定。使用酶消化的原則：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于細(xì)胞內(nèi)抗原道路，如Keratin規模設備，CEA，GFAP等指導。胃蛋白酶則主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的檢測競爭力，如fibronectin，Laminin進一步完善，各型膠原等集聚。一般來言，消化時(shí)間和組織固定的長短呈正比調整推進。在用酶消化狀況，熱修復(fù)后均不能獲得結(jié)果的前提下使用抗原修復(fù)與酶消化結(jié)合的方法，有時(shí)會(huì)取得較為滿意的結(jié)果不斷創新。一般蛋白酶K和微波相結(jié)合建立和完善，但應(yīng)注意，可能檢測的抗原無論何種性質(zhì)均會(huì)在核內(nèi)出現(xiàn)假陽性反應(yīng)[6]參與水平。
三大型、AR的臨床應(yīng)用服務效率。
上個(gè)世紀(jì)九十年代早期，隨著AR技術(shù)的發(fā)展重要意義，IHC應(yīng)用在常規(guī)處理火膠棉包埋的人類顳骨上統籌發展，從分子水平上了解人類發(fā)病機(jī)理和病理生理學(xué)，創(chuàng)立了一個(gè)新的領(lǐng)域[13]體系。使用AR方法生產製造，在常規(guī)處理石蠟切片上評估IC5和ID15單克隆抗體的免疫組化染色[14]。 Charalambous. C等人 [15]強(qiáng)烈推薦MW-AR-IHC方法檢測R-S細(xì)胞的CD30共創輝煌。AR技術(shù)成功應(yīng)用于原位雜交[16]具有重要意義。利用加熱AR-IHC技術(shù)進一步，在福爾馬林固定大部分、石蠟組織切片上用抗毒素#4350檢測nestin[17]。采用抗復(fù)技術(shù)實際需求，在人類上皮解決方案、神經(jīng)、神經(jīng)內(nèi)分泌組織中免疫組化定位DCC蛋白[18]善謀新篇。AR-IHC已廣泛應(yīng)用于臨床的研究中增產。
四、AR的標(biāo)準(zhǔn)化和發(fā)展
抗原修復(fù)的確切原理尚不十分清楚方法，根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道行動力，推測可能是：1、溶解切實把製度、洗脫變性蛋白保供。2、水解作用進行部署。3責任、微波場內(nèi)離子或極性分子直接碰撞的修復(fù)作用[7]”Ｗo好？乖迯?fù)是否可能組建？理論上研究尚未清楚，但是以高溫運行好、高壓首次、對常規(guī)石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)處理經(jīng)驗(yàn)表明，可以提高抗原抗體陽性檢測率部署安排，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)假陽性搖籃。
診斷IHC上的AR技術(shù)及其在基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究已被為數(shù)眾多的文獻(xiàn)和比較多的綜述所闡述。此領(lǐng)域的調(diào)查目的：從分子生物學(xué)診斷常規(guī)上了解情況，在石蠟組織中檢測核酸和蛋白質(zhì)新途徑的可能性深入，從而形成新興的分子形態(tài)學(xué)技術研究。一些新的途徑必須建立標(biāo)準(zhǔn)化的原則和提高其重復(fù)性。[19] 開展研究。目前我國病理科大多數(shù)醫(yī)院病理科尚未在IHC姿勢、AR上標(biāo)準(zhǔn)化，國外已廣泛進(jìn)行進(jìn)行AR的標(biāo)準(zhǔn)化及IHC標(biāo)準(zhǔn)化[20]首要任務。例如在建立新的修復(fù)液方面綠色化，針對不同的抗體預(yù)定義加熱條件和液體濃度、PH值發展、化學(xué)成分保持穩定，從而推動(dòng)AR的標(biāo)準(zhǔn)化。
現(xiàn)AR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫組化（IHC）各領(lǐng)域的研究面向，例如在診斷病理學(xué)和IHC的標(biāo)準(zhǔn)化方面支撐作用。對原來僅表達(dá)在冰凍切片上的抗原，利用AR后絕大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上建設項目，對IHC回顧性研究和臨床病理IHC鑒別診斷最為突出，腫瘤患者術(shù)后的預(yù)后檢測及療效評估具有積極的意義。
北京諾博萊德科技有限公司位于北京市海淀區(qū)相結合，是一家專業(yè)從事生化試劑高效化、分子生物學(xué)試劑、實(shí)驗(yàn)耗材及實(shí)驗(yàn)儀器研發(fā)為產業發展、銷售範圍和領域、服務(wù)為一體的生物科技公司，公司主要經(jīng)營的進(jìn)口品牌包括Qiagen, Omega, Sigma, Invitrogen, Roche, Abcam, Santa cruz, Fermantas（MBI）, NEB, BD, Peprotech, Abnova, R&D systerms, GE, Biovision, Millipore, Amresco, Merck, CST, Axygen, Corning, NUNC, Thermo fihser, Eppendorf等各項要求；產(chǎn)品涉及化工原料更高要求、生化試劑、分子克隆相關(guān)試劑共謀發展、細(xì)胞培養(yǎng)及檢測常用試劑學習、實(shí)驗(yàn)室常用耗材及儀器。
0.1%胰蛋白酶液消化液 NobleRyder P0930
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