1.適用范圍：適合于大量中性福爾馬林固定共謀發展、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)，其效果優(yōu)于微波修復(fù)法和直接煮沸修復(fù)法,使得免疫組化結(jié)果更加可靠結構重塑；推薦使用本法.

2.儀器設(shè)備：市售不銹鋼家用壓力鍋（以不銹鋼制品為好）聽得懂，大小尺寸可根據(jù)需要而定（內(nèi)徑18cm為好）；1000-1500W電爐一臺高質量發展；不銹鋼或耐高溫塑料切片架全方位。

3.所需試劑：0.01M檸檬酸型緩沖液，pH=6.0±0.1

4.操作步驟：

（1）常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟影響力範圍、梯度酒精水化后大局，浸泡于蒸餾水中待用。

（2）取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液（800-1500ml）于壓力鍋中不合理波動，大火加熱直至沸騰宣講手段；將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中積極拓展新的領域。蓋上鍋蓋配套設備，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽相對開放，從噴汽開始計時對外開放，1-2分鐘后，壓力鍋離開熱源深入交流研討，冷卻至室溫（稍冷后資料，可在自來水籠頭下加速冷卻），取出玻片關註度，先用蒸餾水沖洗兩次橫向協同，之后用PBS（pH=7.2-7.4）沖洗兩次，每次3分鐘（2×3'）敢於挑戰。

（3）按公司有關(guān)試劑盒的操作步驟執(zhí)行不斷創新。

5.注意事項：

（1）加熱時間長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時間控制在5-8分鐘為好提供了遵循，時間過長可能會使染色背景加深參與水平。

（2）必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架，不能使用銅架服務效率，以防緩沖液pH值增高而導(dǎo)致掉片明確相關要求。

（3）高壓鍋離開火源后必須等緩沖液冷切后，才能把切片取出統籌發展。

（4）為防止組織脫落深化涉外，玻片必須經(jīng)清潔處理后體系，涂覆Poly-L-Lysine
（5）緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用開展試點。

常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶攜手共進。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱推進一步，主要用于細胞內(nèi)抗原的消化經過，胃蛋白酶主要用于細胞間抗原的消化。工作中要認真參照抗體說明書指示進行消化酶的選擇力度，這樣針對性更強明確了方向，標記效果更理想。

問：為什么要進行抗原修復(fù)：

答：福爾馬林固定時交流，組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成了醛鍵基礎，使得不少抗原決定簇被封閉。同時還不大，由于甲醛的聚合作用高產，使蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡(luò)，也導(dǎo)致了抗原決定簇被掩蓋發揮作用，這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應(yīng)良好。因此，抗原修復(fù)也是影響免疫組化染色結(jié)果的基本因素銘記囑托。

抗原修復(fù)中檸檬酸緩沖液的配制方法：

A液：枸櫞酸引領，C₆H₈O₇.H₂O，21.01g 加水定容至1000ml示範；

B液：枸櫞酸鈉應用前景，C₆H₅Na₃O₇.2H₂O, 29.41g 加水定容至1000ml;

使用時： A液9 ml, B液41 ml，加水至500ml運行好，即可配成工作液首次。

抗原修復(fù)（Antigen retrieval 提高，AR）技術(shù)講道理，是指石蠟擴大公共數據、冰凍意料之外、火棉膠、塑料切片免疫組織化學（IHC）前用胰蛋白酶系統穩定性、尿素還不大、表面活性劑管理、微波緩沖液和金屬鹽等資源配置，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)過程信息。抗原修復(fù)能zui大程度地恢復(fù)在制片等過程中損失的抗原性相互融合，使原來認為不能在石蠟切片上進行IHC的許多抗體獲得了良好的染色結(jié)果首要任務，成為一種有效的補救措施綠色化。本文的目的是概述AR-HIC的發(fā)展不同需求、應(yīng)用和標準化發展。

一、       AR技術(shù)
加熱AR技術(shù)

微波加熱方法. 在傳統(tǒng)標準方法,經(jīng)脫蠟總之、脫水和用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧（化）物酶日漸深入，石蠟切片經(jīng)蒸餾水沖洗，放置在塑料Coplin缸中同時。加入AR液互動式宣講，如蒸餾水、緩沖液模式、金屬鹽液自動化、尿素等，蓋上并置家用微波爐加熱5或10分鐘（注意防止切片干躁）高品質。有時在加熱5分鐘后不折不扣，間隔1分鐘，再加熱5分鐘（在*個5分鐘后檢測液體高度）資源優勢。加熱后高效利用，從微波爐取出塑料Coplin缸，冷卻15分鐘估算。片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次后在PBS液中浸5分鐘講理論，才進行IHC染色。為了保持*的加熱條件不要畏懼，必須設(shè)定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號的Coplin缸 服務為一體，按照不同的抗體設(shè)定不同的加熱時間，盡可能的建立標準的加熱條件逐漸顯現。

微波（MW）加熱過程如下：在盒內(nèi)放入200ml檸檬酸緩沖液（PH6.0±0.1）全會精神，并蓋上帶有小孔的蓋子，微波加熱至沸騰更默契了；將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中先進技術，放入已沸騰緩沖液中，有作者提供做免疫組化時采用微波爐中等功率800W[3]不合理波動，微波爐選用解凍檔的國產(chǎn)家用微波爐（根據(jù)目前的研究,建議用醫(yī)用微波爐）宣講手段，中檔繼續(xù)處理10-20分鐘；取出微波塑料缸冷卻至室溫積極拓展新的領域，從緩沖液中取出玻片配套設備，片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）沖洗兩次相對開放，每次3分鐘推進高水平。
盡管有少數(shù)作者[4]認為經(jīng)高溫后冷卻這一步省略脫穎而出。在我們觀點，15分鐘的冷卻必須的幾點理由：1好宣講、如這一步省略註入新的動力，對于有些抗體而言，會降低AR-IHC染色強度。2雙重提升、突然從高溫到低溫可導(dǎo)致組織片掉片。3事關全面、可能引起形態(tài)學的變化表現明顯更佳。
  單純加熱方法.  將切片放入盛有檸檬酸緩沖液的容器中,置電爐（600W）上加熱至沸騰，并持續(xù)10min 技術節能。Shi等人[2]用單純加熱方法與微波加熱方法比較IHC染色強度指導，顯示兩種方法導(dǎo)致相同的染色強度。
  高壓加熱方法.  Shin等人[5]發(fā)展了含水高壓鍋煮沸方法國際要求，來增強福爾馬林固定的腦組織tau蛋白免疫反應(yīng)性流動性。將切片連同檸檬酸緩沖液放入高壓鍋內(nèi)，加熱至產(chǎn)生噴氣行業內卷，并持續(xù)2min追求卓越，壓力鍋離開熱源，加熱長短的控制很重要參與能力，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋到壓力鍋離開熱源總時間在5-8分鐘合理需求，時間過長可能會使染色背景加深。現(xiàn)試劑公司提供的大多數(shù)抗體都建議使用高壓鍋煮沸方法充分發揮，這幾年的實踐表明高質量，采取此方法可避免假陽、陰性選擇適用，使IHC染色效果更佳管理。
非加熱AR技術(shù)
   非加熱AR技術(shù)包括酶消化、酸水解等方法業務指導。目前改進措施，主要是酶消化，酶消化是以化學的方法來打斷醛鍵長足發展，修復(fù)抗原今年。

胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05％或0.1％PH7.8的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可結構不合理；或用0.125%的液體胰酶動手能力。將切片放入濕盒內(nèi)37oC溫箱中消化18-20分鐘。
    胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4％的胃蛋白酶效果較好；

鏈霉蛋白酶消化法 . 將鏈霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中重要的意義，濃度為o.1％持續，消化時間20min。
    抗原修復(fù)的方法選擇再獲，關(guān)系到組織抗原能否暴露充分產品和服務，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應(yīng)當根據(jù)不同的抗原特點激發創作，采用不同的修復(fù)方法前景。對某些細胞內(nèi)抗原（如Fas進一步意見、Bax增幅最大、FⅧ等）和細胞間質(zhì)抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片生產能力。常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶標準。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱堅持好，主要用于細胞內(nèi)抗原的消化即將展開，胃蛋白酶主要用于細胞間抗原的消化。工作中要認真參照抗體說明書指示進行消化酶的選擇特性，這樣針對性更強傳承，標記效果更理想。
    總之,以高壓加熱方法建言直達、微波加熱方法較為穩(wěn)定, 高壓加熱方法效果優(yōu)于微波加熱方法和單純加熱方法多種。溶液的濃度對修復(fù)效果無任何影響，而PH值則影響較大充分發揮。緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCL較常用發展成就。前人的研究表明，溫度高修復(fù)時間短[6]重要方式。解放軍第251醫(yī)院根據(jù)臨床病理診斷開展面對面、鑒別診斷和研究的實際需要，在抗原修復(fù)方法規(guī)范研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)上非常重要，創(chuàng)用了胰蛋白酶—尿素聯(lián)合消化技術(shù)進一步提升、鹽酸水解暴露抗原技術(shù)和MW—表面活性劑Triton X—100（MW—TX）修復(fù)抗原技術(shù) [7] I造一處？乖┞痘蚩乖迯?fù)方法較多改革創新，其中發(fā)MW—枸櫞酸緩沖液使用較多，效果文化價值。MW修復(fù)抗原的方法是石蠟切片脫蠟形式、水洗后放入修復(fù)液中，用250W的輸出功率2X5min不斷完善，待冷卻至室溫按常規(guī)處理數字化。目前AR過程已成功應(yīng)用在BioTek全自動免疫組化染色儀中方便。

二、AR應(yīng)注意的問題

加熱持續(xù)時間和強度是重要的影響因素之一各領域，

AR液的PH值應用領域、濃度、化學成分也是重要的影響因素之一進行培訓。

使用低PH值AR液必須使用陰性對照片發展機遇，以防止定位不準[9]。Shi等人[10]強調(diào)修復(fù)緩沖液的PH值對某些抗原的修復(fù)十分重要,實驗中我們也發(fā)現(xiàn)要獲得滿意結(jié)果必須選擇抗原修復(fù)液的zui適PH值法治力量。在常規(guī)石蠟切片做AR-IHC全技術方案，采用不同濃度的Alcl3液做AR液，發(fā)現(xiàn)4%的Alcl3取得的染色[11]共享。在修復(fù)的抗原中信息化，金屬鹽可影響蛋白的結(jié)構(gòu)。鄭輝等人[12]使用0.01mmol/LPBS生動、0.01mol/L檸檬酸緩沖液新型儲能、0.1mol/L Tris-HCL緩沖液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修復(fù)抗原新品技，發(fā)現(xiàn)其陽性強度逐漸增強範圍。

高溫抗原修復(fù)因其機理相當復(fù)雜，對某些存在的問題很難用設(shè)計對照的方法加以解決紮實做，有些抗體在冰凍切片上呈陰性反應(yīng)空間廣闊，但在石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好的顯示。對某些應(yīng)表達在胞漿或表達在核內(nèi)的抗原，經(jīng)過量修復(fù)后雙重提升，絕大部分表達在核內(nèi)，例如事關全面，P185表現明顯更佳、Bcl-2、P-gp技術節能、Nm23技術的開發，而有些表達在核內(nèi)的抗原經(jīng)過量修復(fù)會出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，例如P53飛躍、PcNA更高效、Ki-67等[6]。在使用該方法時一定小心重要部署，對結(jié)果的判斷也要客觀地作出分析具體而言，侯寧等人發(fā)現(xiàn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TRT）經(jīng)過抗原修復(fù)與不經(jīng)過抗原修復(fù)，其染色效果明顯不同，后者的陽性率明顯高于前者[8]喜愛。操作中還應(yīng)注意如下問題：
1重要的角色、熱處理后應(yīng)注意自然冷卻。
2向好態勢、熱處理時要防止切片干燥平臺建設。
3、應(yīng)根據(jù)不同的抗體選擇合適的抗原修復(fù)方法貢獻力量。
4使用、一批抗原的檢測其溫度和時間一定保持*。
5發行速度、注意形態(tài)學結(jié)構(gòu)的改變（一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿會明顯的破壞更加堅強，而對細胞核的影響較大，會出現(xiàn)核破裂奮勇向前，蘇木素淡染等現(xiàn)象不斷豐富，而經(jīng)酶水解的切片，其細胞漿破壞視消化時間而異組建，但核破壞較輕）。
6效果較好、如果在常用的緩沖液中無法實現(xiàn)抗原修復(fù)重要的意義，或經(jīng)修復(fù)后抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液等多個領域，或加一些螯合劑再獲，如EDTA等可改善某些抗原的修復(fù)。

用于IHC消化的酶很多應用擴展，所選酶的種類體驗區，使用的濃度，PH值發揮效力，消化時間及溫度等均要視組織固定的不同新格局，所檢測抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而異安全鏈，應(yīng)通過預(yù)實驗摸索, , 確定顯示。使用酶消化的原則：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于細胞內(nèi)抗原，如Keratin真正做到，CEA科普活動，GFAP等。胃蛋白酶則主要用于細胞間質(zhì)抗原的檢測強化意識，如fibronectin長期間，Laminin，各型膠原等。一般來言高端化，消化時間和組織固定的長短呈正比至關重要。在用酶消化，熱修復(fù)后均不能獲得結(jié)果的前提下使用抗原修復(fù)與酶消化結(jié)合的方法用上了，有時會取得較為滿意的結(jié)果提升行動。一般蛋白酶K和微波相結(jié)合，但應(yīng)注意關註，可能檢測的抗原無論何種性質(zhì)均會在核內(nèi)出現(xiàn)假陽性反應(yīng)[6]研究進展。

三、AR的臨床應(yīng)用連日來。
   上個世紀九十年代早期快速融入，隨著AR技術(shù)的發(fā)展，IHC應(yīng)用在常規(guī)處理火膠棉包埋的人類顳骨上系統，從分子水平上了解人類發(fā)病機理和病理生理學增強，創(chuàng)立了一個新的領(lǐng)域[13]。使用AR方法交流等，在常規(guī)處理石蠟切片上評估IC5和ID15單克隆抗體的免疫組化染色[14]更加廣闊。 Charalambous. C等人 [15]強烈推薦MW-AR-IHC方法檢測R-S細胞的CD30。AR技術(shù)成功應(yīng)用于原位雜交[16]提高。利用加熱AR-IHC技術(shù)可以使用，在福爾馬林固定、石蠟組織切片上用抗毒素#4350檢測nestin[17]紮實。采用抗復(fù)技術(shù)效高化，在人類上皮、神經(jīng)等地、神經(jīng)內(nèi)分泌組織中免疫組化定位DCC蛋白[18]最為顯著。AR-IHC已廣泛應(yīng)用于臨床的研究中。
四規定、AR的標準化和發(fā)展
   抗原修復(fù)的確切原理尚不十分清楚環境，根據(jù)國內(nèi)外文獻報道，推測可能是：1供給、溶解優勢與挑戰、洗脫變性蛋白。2解決方案、水解作用趨勢。3、微波場內(nèi)離子或極性分子直接碰撞的修復(fù)作用[7]上高質量∫徽臼椒?？乖迯?fù)是否可能廣度和深度？理論上研究尚未清楚，但是以高溫引領作用、高壓加強宣傳、對常規(guī)石蠟切片進行抗原修復(fù)處理經(jīng)驗表明，可以提高抗原抗體陽性檢測率用的舒心，同時也會出現(xiàn)假陽性技術發展。
    診斷IHC上的AR技術(shù)及其在基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究已被為數(shù)眾多的文獻和比較多的綜述所闡述。此領(lǐng)域的調(diào)查目的：從分子生物學診斷常規(guī)上集成，在石蠟組織中檢測核酸和蛋白質(zhì)新途徑的可能性重要手段，從而形成新興的分子形態(tài)學。一些新的途徑必須建立標準化的原則和提高其重復(fù)性穩定性。[19] 像一棵樹。目前我國病理科大多數(shù)醫(yī)院病理科尚未在IHC、AR上標準化去突破，國外已廣泛進行進行AR的標準化及IHC標準化[20]能運用。例如在建立新的修復(fù)液方面，針對不同的抗體預(yù)定義加熱條件和液體濃度智能設備、PH值不可缺少、化學成分，從而推動AR的標準化喜愛。
    現(xiàn)AR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫組化（IHC）各領(lǐng)域的研究醒悟，例如在診斷病理學和IHC的標準化方面。對原來僅表達在冰凍切片上的抗原高質量，利用AR后絕大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上，對IHC回顧性研究和臨床病理IHC鑒別診斷記得牢，腫瘤患者術(shù)后的預(yù)后檢測及療效評估具有積極的意義註入了新的力量。