谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B C10H17N3O6S
谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B C10H17N3O6S 特性: 粒度：45-165µm 流速：75cm/h 工作PH：4-10 耐壓：0.3Mpa 載量：＞5mg 谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶
谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B C10H17N3O6S
pGEX載體表達(dá)的外源蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合貢獻力量，因此可以通過(guò)谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。GSTs是一類(lèi)以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作為底物，通過(guò)形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶傳遞。由于GST對(duì)底物的親和力是亞毫摩爾級(jí)的，因此谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹(shù)脂對(duì)GST及其融合蛋白的純化效率很高深入⌒Ц?？梢杂煤坞x谷胱甘肽的緩沖液洗脫結(jié)合GST融合蛋白。樹(shù)脂用3mol/L NaCl的緩沖液再生基礎。谷胱甘肽瓊脂糖對(duì)GST融合蛋白的結(jié)合能力很強(qiáng)（每毫升柱床體積的樹(shù)脂能結(jié)合8毫克融合蛋白）性能。
特性: 粒度：45-165µm 流速：75cm/h 工作PH：4-10 耐壓：0.3Mpa 載量：＞5mg 谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶
使用說(shuō)明：
谷胱甘肽樹(shù)脂的處理:
1.輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹(shù)脂的容器，將樹(shù)脂混成勻漿對外開放。
2.取部分勻漿放入15mL聚丙烯管（每100mL 細(xì)菌培養(yǎng)物大約需要2mL 勻漿）技術創新。
3.4℃ 500 g離心5分鐘，小心去掉上清資料。
4.在樹(shù)脂中加入10倍柱床體積預(yù)冷的PBS廣泛應用，顛倒數(shù)次混勻，4℃ 500 g離心5分鐘橫向協同，小心去掉上清哪些領域。
5.每毫升樹(shù)脂加入1毫升冷的PBS，制成50%勻漿不斷創新，顛倒數(shù)次建立和完善，混合均勻，懸液冰上放置待用參與水平。制備細(xì)胞抽提物：
6.每100毫升培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重懸于4mL PBS緩沖液中大型。
7.加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。
8.用針筒將10mL 濃度為0.2%的TritonX-100 強(qiáng)行注入黏稠的細(xì)胞裂解物中聯動，劇烈振動(dòng)數(shù)次混勻增持能力。加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL, 4℃振動(dòng)溫育10分鐘，4℃ 3000 g離心30分鐘生產體系，去除不溶性細(xì)胞碎片服務，上清轉(zhuǎn)移到一只新管中，加入DTT至終濃度1mmol/L能力和水平。純化融合蛋白：
9.細(xì)胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹(shù)脂勻漿混和覆蓋，每100毫升細(xì)菌培養(yǎng)物加2mL樹(shù)脂，于室溫輕搖30min研究。
10.混合物于4℃以500 g離心5分鐘高效，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
11.沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒離心管數(shù)次混勻機構，洗去未與樹(shù)脂結(jié)合的蛋白的特性。
12.4℃以500 g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳基礎。
13.重復(fù)步驟11和12兩次提供堅實支撐。
14.結(jié)合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫，也可用凝血酶高產、腸激酶或Xa 因子切割信息化技術，釋放靶蛋白。
用谷胱甘肽洗脫融合蛋白：
15.沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液良好，室溫輕輕攪動(dòng)10min逐步顯現，洗脫樹(shù)脂上結(jié)合的蛋白。
16.4℃以500 g離心5分鐘引領，上清（含洗脫的融合蛋白）移至新管中自動化裝置。
17.重復(fù)步驟a和b兩次，合并3次上清應用前景。蛋白酶解從結(jié)合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：
18.在結(jié)合了融合蛋白的樹(shù)脂中加入凝血酶有很大提升空間、腸激酶或Xa 因子（根據(jù)融合蛋白中的位點(diǎn)選擇），每mL樹(shù)脂加入50單位溶于1mLPBS的蛋白酶預下達。顛倒離心管數(shù)次混勻的有效手段，室溫下振蕩2—16小時(shí)。用小規(guī)模實(shí)驗(yàn)確定精確時(shí)間方案。
19.4℃以500 g離心5分鐘大大提高，上清小心移至新管中。（GST仍結(jié)合在樹(shù)脂上研究成果，而靶蛋白在上清中取得了一定進展，蛋白酶也在上清中，仍需要分離）
20.10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質(zhì)組成大面積。試劑配制：谷胱甘肽洗脫緩沖液：10mmol/L還原型谷胱甘肽積極參與，50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)
