TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit-
可在室溫條件下開展，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆等地，陽性率接近100%服務為一體，并且免冰浴改善、免熱激領域、免藍白斑篩選共享應用，還可以連接長達10kb的DNA片段的必然要求。TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit-
TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit
TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit-
目錄號：42117
產(chǎn)品內(nèi)容：
產(chǎn)品成份 | 42117-20 (20 rxn) | 42117-80（80 rxn） |
pTOPO-TA/Blunt Vector(30ng/ul) | 20 ul | 80 ul |
1000bp Control (30ng/ul) | 5 ul | 5 ul |
10x Enhancer | 20 ul | 80 ul |
保存條件：
-20℃，存放 12 個月取得了一定進展，不影響使用效果完善好。
產(chǎn)品簡介：
可在室溫條件下，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆積極參與，陽性率接近100%問題分析，并且免冰浴、免熱激交流研討、免藍白斑篩選更加完善，還可以連接長達10kb的DNA片段。
克隆步驟（≤3kb 片段）： 簡化步驟（≤10kb 片段）-- 免復蘇建設應用，免液體 LB
1支撐作用、連接：室溫 5 分鐘； 1動力、連接: 37℃連接 5 min同時。
2互動式宣講、轉(zhuǎn)化：室溫 5 分鐘； 2模式、轉(zhuǎn)化：冰浴 5 min自動化，42℃熱激 1 min，冰上 2 min發揮重要帶動作用。
3意向、復蘇：180rpm、37℃振蕩培養(yǎng) 10 分鐘文化價值；涂板形式。 3、取全部菌液涂板不斷完善，37℃倒置培養(yǎng)數字化。
操作步驟：
1. PCR 產(chǎn)物的制備：
a. 引物要求：引物不能磷酸化。
b. 酶的選擇：根據(jù)需要選擇DNA 聚合酶營造一處，該載體兼容PCR 產(chǎn)物的A 末端和平末端改革創新。
c. 電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的量和質(zhì)量：
①僅有目的條帶知識和技能，可直接進行連接反應取得顯著成效，無需純化；
②如果有多條帶實現，建議凝膠回收 DNA 片段（DC011-100）;
③如果以質(zhì)粒為模板的擴增不容忽視，則必須進行凝膠回收，因為模板質(zhì)粒也會長出非目的菌落服務體系。
2. 連接反應：
1）室溫（20℃-37℃）建立連接體系（10ul 體系）：
純化后的 PCR 產(chǎn)物 | 0.5-8ul |
pTOPO-TA/blunt Vector | 1ul |
10 ? Enhancer | 1 ul |
滅菌水 | X ul |
總體積 | 10 ul |
不同大小插入片段的推薦用量：
插入片段大姓f服力。╞p） | 最佳用量（ng） |
100-1000 | 10-40 |
1000-2000 | 40-80 |
2000-5000 | 80-150 |
加完試劑后，輕彈管底混勻（或輕輕吹打混勻）分析，點甩離心收集所有液體在離心管底表示。
2) 室溫（20℃-37℃）連接 5 分鐘。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞非常激烈，或置于冰上備用競爭力所在。
3. 轉(zhuǎn)化、復蘇領域、涂板：
1）100ul 感受態(tài)細胞溝通機製，置于室溫解凍（約 1 分鐘左右），輕撣幾次將細胞均勻懸浮註入新的動力。
2） 加入 10ul 連接液領先水平，輕輕混勻，室溫（20℃-37℃）放置 5 分鐘雙重提升。
3） 加入 500ul 平衡至室溫的 LB 或者 SOC 培養(yǎng)基(不含抗生素)戰略布局，37℃ 180 rpm 振蕩培養(yǎng) 10 min品牌。
（注意：大于 3kb 的片段，振蕩培養(yǎng)時間延長至 30-60 分鐘求得平衡，可以增加轉(zhuǎn)化子紮實做。或者用簡化步驟）
4） 取 200?l 菌液涂板(含氨芐青霉su 50-100ug/ml）至關重要，培養(yǎng)過夜提供深度撮合服務。（為得到較多克隆，4000 rpm 離心 1 min的發生，吸棄掉部分上清組成部分，保留 100-150ul，輕彈懸浮菌體新的動力，取全部菌液涂板）
注意：如果使用 5ul 體系的過程中，各成分按照比例減半，使用次數(shù)可以加倍廣泛關註。
4. 轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：
本制品陽性率相當高促進進步，一般情況下，可以達到所見即所得優勢領先，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌迎來新的篇章，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就包含插入推動並實現。因此插入片段不超過 2-3kb 的情況下可以不用鑒定直接挑 1-2 個菌去測序薄弱點。
1） 菌落 PCR 檢測：挑單菌落于 10ul 無菌水中，混勻優化程度，取 1ul 置于 25ul PCR 體系,用 PCR 引物或者M13 通用引物去鑒定陽性克隆積極性。
2）用通用 M13F（-20）/M13R（-26）引物測序來確定是否含有目的克隆。
